这种体 限制性核酸内切酶 微生物能够在获得的其他来源的DNA中识别自己的DNA。 系已经发展到识别自我和非自我, 依靠细胞内部的两种酶: 修饰性甲基化酶和限制性核酸内 切酶。这种甲基化酶在新生的双链DNA链上以特定的方式对各种核苷酸残基增加甲基集 团。这种识别序列在长度上通常有4到7个碱基对并且是回文序列,这就是说,这种序列在 DNA一条链上与它互补链是相同的。 大多数生物体具有许多不同的修饰性甲基化酶。 限制 性核酸内切酶作为修饰性酶识别相同的序列, 但是代替甲基化, 在序列上切割DNA。 然而, 核酸内切酶不会切割自身序列但是会降解外援DNA。 这种识别和切开双链DNA特殊序列 的特性已经成为从许多类型的微生物中切除DNA片段的基础。 不同种类的限制性内切酶被发现,被称为1,2,3,和4类型。只有2类型对新的 DNA 技术是重要的。 2 类型限制性内切酶有特殊的重要性因为他们的特殊序列并且可以在精确的位置使双链 DNA 断裂。用这种方式切开长的外源 DNA 分子成为短的片段也可以在质粒载体做一个单 一缺口,在这位置上 DNA 片段可以被插入。在一些酶的作用下,切口产生单一链末端并且 对于一个给定的限制性核苷酸得到的所有片段的目的序列是相同的。 用这种方法, 任一片段 通过一种特殊的退火增殖可以与其他通过相同核酸内切酶切割的片段进行配对, 因此创造出 一个杂交分子。 自从来自大量细菌的限制性核酸内切酶发现以后, 命名细菌的一套专业术语 就被采用了。 宿主微生物的属名和种名由类型的首字母确定, 并且种名的前两个字母用斜体 字形成三个字母的缩写。例如,E。coli,Eco.菌株和类型用无下滑线记号鉴定并且核酸内切 酶的号码用罗马数字?EcoRⅡ. 不同的核算内切酶可以用于产生不同尺寸的 DNA 片段使不同的 3‘或 5’单链延长。这 种 DNA 片段可以用电泳纯化。 通过 EcoR1 水解 PBR322 的单一目的位点或者通过限制性核酸内切酶因为有一个单一的 目标位点,改变环状制粒成为线状 DNA 分子。 这个位点可以通过有两个折叠对称轴的 2 型限制性核酸内切酶识别:它们可以是
  4,
  5, 或 6 核苷酸序列。DNA 切割酶可以产生既不是平的也不是粘性末端,粘性末端很少有不成 对的核苷酸终点在末端既不是 3‘羟基也不是 5’磷酸基团。许多有用的限制性核酸内切酶 识别 4 或 6 核苷酸再生位点。因此 2 型 Hinc 酶切割六个碱基对序列的中间位置将导致钝边 DNA 分子形成,只能通过 DNA 连接酶以很低的效率被结合。EcoR1 切割远离中心的识别 位点并且由于酶切割位点的自然再生性导致双链 DNA 片段和单链接头或者粘性末端的形 成。当这些片段混合起来时,氢键连接发生在单链序列互补的碱基中最后形成联合体。 平均每 4096 个碱基对中有一个特殊的 6 核苷酸序列出现。识别 4 核苷酸序列的内切酶所 产生的片段, 其平均长度应为 256 个碱基对: 指出一个 35000 分子量的典型蛋白质所需要的 密码子的 DNA 总数大约是 1000 个核苷酸的长度。 用于克隆的 DNA 片段比使用限制性内切酶也需要被获得:这些包括机械剪取,声波降解 法,化学合成法,或者使用反转录酶从真核 RNA 模板上合成‘复制 DNA’ 。最后的方法克 服了高等真核生物大部分基因所具有的典型特征内含子或间插序列的问题。真核生物 DNA 在细菌中复制时内含子不能被移动,然而在真核生物表达时他们通过连接初始 RNA 在基因 复制时被移动。 接合载体 接合载体 插入和链接 DNA 片段进入质粒载体可以通过好几种方法完成。 使用大肠杆菌或 T4 噬菌体 DNA 处理的 DNA 混合片段将在克隆质粒和 DNA 分子中产 生共价连接。共价磷酸二酯键将在通过粘性末端已经退火的片段中形成。 一个最低效率的连接方法是平头末端或完全平齐末端连接。在这种情况下 DNA 分子没有 单练 DNA 的投影基因,要求高浓度的 DNA 末端和酶以提高连接。然而这种方法在当前水 平下不能用于广泛的核酸内切酶广泛增长 DNA。当这种杂交行成时,他不能被用于产生原
始 DNA 片段的核酸内切酶切割。 这种可能存在的劣势可以使用 ie 接头被克服,短的合成多核苷酸,包括一个或更多核酸 内切酶序列。许多接头现在已经存在,它允许 DNA 目的片段简单的修饰。接头序列的使用 允许平头末端连接到 DNA 片段,通过适当的核酸内切酶切割接头形成特殊的目的需要。用 这种方法克隆的片段可以简单的从重组质粒中重复分离,通过正确的核酸内切酶消化。 一个很少使用的方法包括在载体 3‘末端加入一个有几个脱氧鸟苷的尾巴,并且脱氧胞 嘧啶插入到剩余的 3’末端,因此形成插入互补的伸长单链和载体。通过碱基配对结合,连 锁反应发生了。 插入 DNA 片段的质粒新产品叫做一个假想质粒。 转化 这种让 DNA 产品进入细菌的技术已经很长时间被重视,并且可以包括染色体或质粒 DNA。当噬菌体 DNA 被包裹的时候转化就发生了。 一个典型的质粒转化实验将有一个 DNA 分子的异构混合物, DNA 分子只有很少数 量包括一个单一的载体质粒连接到单链 DNA 片段。当大肠杆菌用于转化 DNA 分子时,溶 解到
  0.1mol/l 氯化钙溶液中,他将有能力或者具有渗透性与细菌细胞混合。这种细胞然后在 37 度下加热 5 分钟使 DNA 收缩。 这种细胞然后转入到肉汤中经过短周期培养就能表达出新 的 DNA 所需要的性状。 这种细菌携带的杂交分子通过特殊的筛选过程被鉴别和纯化:他们的 杂交质粒被筛选并且表达, 或者新产品被筛选和研究。 转化效果是每 ug 克隆基因大约有 106 个转化。 当噬菌体质粒和黏端质粒(包括正常质粒和λ噬菌体粘性末端)也能被利用时,质粒 载体在其他的细菌已经得到发展。 革兰氏阴性菌,特别是大肠杆菌,已经广泛的用于重组 DNA 工作。特殊的质粒载体在 革兰氏阳性菌也已经得到发展,特别是枯草芽孢杆菌和链霉菌。 在真核生物体系中转化新基因工程技术的大量研究正在进程中。酵母是作为真核克隆 宿主的强烈候选者,并且具有两种不同功能的质粒使用来自酵母的 2uDNA 和来自大肠杆菌 的 pBR322 质粒已经得到发展并且成功应用。 使用特殊动物病毒基因在动物细胞中克隆可以 完成,例如,猴病毒 SV
  40。植物细胞克隆不能这么好的建立;根癌土壤杆菌的 Ti 质粒被证 明是有用的。 在高等植物中重组 DNA 技术正被视为自身蛋白质在增值中增长的重要性,允许有用植 物直接基因修饰以提高他们的生产率。 在基因工程植物中这种表达一个新型基因的功能已经 被报导。一个重要原因是植物中基因表达的分子基础之间相互认识的限制。此外,许多重要 植物特征的基因还没有被确认。 然而, 改变细胞基因结构的人在微生物基因工程中是有用的, 如果它们不能再生进入整个植物,改变植物细胞基因结构只有很小的价值。不幸的是,相比 较而言, 只有很少农艺象征作物可以在细胞培养时立即再生。 通过基因工程改良作物的可能 性毫无疑问是巨大的,但是在他实现之前在植物分子生物学所有领域的基本研究是必须的。 转化株(已经转化的细菌细胞)的识别 在大多数克隆实验中方案最主要的部分将是 转化株 的识别 与已经转化了的重组克隆体识别有关。通常的,转化 DNA 进入宿主细胞的总数量非常小于 宿主染色体 DNA,因此来自转化片段的表达产品的识别将是非常困难的。然而各种各样的 方法已经发展了去识别携带期望 DNA 片段的克隆体。 (a) 互补 一些内部基因能够补充在接受者染色体上有复制缺陷的相同基因:那 就是说,他们遗传密码是正常的,有效地而受体是有缺陷的。例如,半乳糖 苷酶+基因(为β-牛乳糖编码)将补充一个半乳糖苷酶,β-牛乳糖缺陷宿主 产生半乳糖苷酶+接受者, 接受者可以在马康氏琼脂培养基作为红色群落被选 择。 (b) 抗生素抵抗基因 这些基因在正常易感染的细胞中授予抵抗一种抗生素。这
可以使用质粒 pBR322 举例说明,质粒 pBR322 携带四环素和氨苄青霉素抵 抗基因并且转化株可以用包含这些抗体中的一种的媒介被选择:外源 DNA 通常被克隆进入基因编码以抵抗其他基因,不选择抗生素。 (c) 杂交 分析一个重组 DNA 分子的集合体或克隆细胞广泛使用的方法是通过 菌落或空斑杂交。包含重组 DNA 的细胞被转移,用消化纤维素过滤和细胞 溶解。纯化的,互补的放射性核酸然后在消化纤维连接的细胞里杂交成为 DNA。互补的 DNA 将会杂交并且可以通过射线自显技法被发现。杂交长度 将反映出互补的数量。来自一个 mRNA 模板用合成法合成的复制 DNA 也可 以以一种相思的方式筛选消化纤维素过滤的重组 DNA。 (d) 限制性核酸内切酶分析 这种方法可以被用于测定是否克隆的 DNA 作为一 个标准 DNA 分子产生了相同尺寸的片段。限制性核酸内切酶表明(提供) 了映射片段通常是序列分析的先决条件。 (e) 免疫学方法 免疫学方法正被越来越多的使用并且对发展抗体有很大的依 赖性,主要是抵抗蛋白质产品。 识别重组 DNA 在工业克隆方面有很高的秘密,结果导致大多数研究都保留秘密信息。 这是不可避免的但在新技术在商业重要性方面是令人遗憾的。 基因工程必须被正确的看做应用遗传学的大量框架的顶点,它已经如此成功的发展, 超过了过去的 30 年。尽管如此,他确实是最令人兴奋的和有潜力的,这最有创造性的技术 可以达到用于工业的遗传学者。 重组 DNA 技术在学术和经济上的应用是无限制的,包括: 增加特殊的基因产品的产量。 提高合成特殊最终产品的比率可以通过克隆添加一个酶进入有机体,或者通过定点诱 变特定修改一个已经克隆的酶 (例如, 克隆固氮路径是通过大肠杆菌进入到噬甲基菌属食甲 基嗜甲基菌单细胞蛋白的 ICI) 。 通过转移一个特殊的活性进入一个更理想的宿主有机体‘裁剪‘一个有机体。 在不久的将来重组 DNA 技术将在制药生产上有很重要的方面。他可能从哺乳动物获得 资源进入细菌生产基因, 并且获得在商业范围内的产品, 这些商品可以通过哺乳动物基因进 行编码。这些特殊重要的复合物包括胰岛素,人类生长激素,没,抗生素,干扰素和疫苗。 随着时间发展和商业应用充满希望,在以后的十年将允许这些产品存在。在兽医领域,新的 动物疫苗将会通过基因工程获得。 尽管外源基因的克隆现在常规的是使用大肠杆菌, 一个很 重要的原因是有机体分泌很少的蛋白质。 蛋白质通过信号序列具有一些特征, 包括不易被水 沾湿的氨基酸残基, 这种氨基酸残基决定输出的蛋白质穿过细胞膜。 在输出过程中信号缩氨 酸被切掉产生蛋白质或激素。 部分问题使用大肠杆菌被克服, 通过融化和其他外源基因得到 的产品的基因,这些基因产品是被输出的;其他基因产品靠近将是这些细胞更加有漏洞。然 而,一些细菌像芽孢杆菌,在基因工程中正越来越多的被使用,并且它可以分泌多于 50 种 蛋白质,毫无疑问的在外源基因克隆的商业应用中将有很重要的应用。 (90 页 6 行)
 

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